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人体由成百上千种细胞组成，这些不同类型的细胞虽然拥有相同的遗传物质，但却能行使各异的功能。一方面，这是由于不同细胞类型中基因的表达不同，大量转录组的研究已经提供了许多证据；另一方面，即使一个基因在不同种类细胞中表达类似，它的功能也可能因细胞类型而异。目前，大部分对于人类基因功能的研究是在癌细胞或转化（transformed）的细胞系中进行的，对于末端分化（post-mitotic）的正常细胞种类中基因功能的研究却十分有限。以神经细胞为例，它们是一类形态和功能高度特化的细胞，且与众多人类疾病相关，包括神经发育性疾病（如自闭症）和神经退行性疾病（如老年痴呆症）。技术上的限制阻碍了对于人类神经特异性基因功能的研究。一方面，实验材料很难获得。虽然人类神经元可以从死后脑组织（post-mortembraintissue）获得,但是在这些细胞中很难进行遗传学操作以研究基因功能；另一方面，常用于控制基因表达的方法RNAi有效率低、脱靶率高等缺点。
年8月15日，加州大学旧金山分校的MartinKampmann团队和NIH的MichaelE.Ward团队（共同一作为田瑞琳、MariamA.Gachechiladze、ConnorH.Ludwig博士）在Neuron发表的题为CRISPRinterference-basedplatformformultimodalgeneticscreensinhumaniPSC-derivedneurons一文中，作者通过结合此前开发的基于人类诱导多能干细胞（humaninduced-pluripotentstemcell,iPSC）分化神经元的技术，以及基于CRISPR干扰（CRISPRinterference,CRISPRi）的基因操作技术，开发出了一个在人类神经元中进行高通量，多模式（multimodal）遗传筛选的平台，为系统性研究人类神经元中的基因功能提供了新的途径。
首先，为了能在体外产生大量组成均一（homogenous）的人类神经细胞，作者采用了之前开发的i3Neuron技术即：将四环素诱导的Neurogenin2(Ngn2)表达元件定点插入到iPS细胞的AAVS1位点（AAVS1safeharborlocus），通过在培养液中添加诱导剂Doxycycline,即可得到大量均一的谷氨酸能神经元（glutamatergicneurons)。接着，为了实现有效的，持久的基因表达操控，作者将CRISPRi元件,即dCas9-KRAB融合蛋白,定点插入到上述iPS细胞的CLYBL位点(CLYBLsafeharborlocus)。通过实时定量PCR(qRT-PCR),Westernblot和免疫荧光染色（immunofluorescence），作者证明了在这些神经元的不同分化阶段都可以稳定、有效地敲低内源基因的表达。
相比于CRISPR敲除（CRISPRcutting,CRISPRn）,CRISPRi不会造成DNA断裂，因此避免了DNA损伤引起的细胞*性。
接着，运用已建立的这一套细胞体系，作者在干细胞和神经细胞中分别进行了大规模的基于存活（survival-based）的CRISPRi筛选。作者使用的sgRNA文库包含超过个sgRNA，用于敲低多个基因（包含所有激酶（kinase）及药物靶点），以观察它们对于干细胞和神经细胞生长／存活的影响。通过使用作者新开发的MaGeCK-iNC算法，作者鉴定出影响干细胞和神经细胞存活的基因。将这些基因与已发表的在癌细胞／转化的细胞系中鉴定出的“人类标准必需基因”（Gold-standardhumanessentialgenes,）进行比较，作者发现，除了一些共同必需基因外，有许多基因表现出细胞类型特异的必需性。比如，在所有影响神经元细胞存活的基因中，有近三分之一并不会影响干细胞或者癌细胞的生长或存活。另外，作者还发现一些基因，包括MAP3K12(编码DLK蛋白)，MAPK8(编码JNK1蛋白)和EIF2AK3(编码PERK蛋白),抑制它们的表达会特异性地改善神经元的存活，这与已发表的其他研究结果一致。
为了检验上述筛选结果的可靠性，作者对92个筛选出的基因进行了多角度的批量验证（batchvalidation）。首先，作者重复了初次筛选的条件，发现几乎全部的基因都表现出与初次筛选吻合的表型。其次，为了排除抑制某些基因表达会影响神经细胞分化而不是存活的可能性，作者开发了一个可诱导的CRISPRi系统来实现神经元条件性的基因抑制。使用这一系统进行验证，作者发现，除了一个基因以外，其余基因的确直接影响了神经细胞的存活而不是分化过程。另外，在批量验证中，作者还引入了一个新的条件即将神经细胞与神经胶质细胞（astrocytes）共培养。结果发现，对于绝大多数筛选出的基因，与胶质细胞共培养并不会改变它们对于神经细胞存活的表型。
为了进一步探明为什么有些基因表现出神经特异性的表型，作者对其中的27个基因进行了CROP-seq分析。CROP-seq是一种结合了CRISPR筛选与单细胞转录组测序的技术，它可以让我们鉴定出每个细胞中所表达的sgRNA，以及敲低这个sgRNA对应基因对这个细胞转录组引起的变化。分析了2万个干细胞和2万个神经细胞CROP-seq数据后，作者发现了许多有趣的现象。比如，同一个基因在干细胞和神经细胞中敲低会引起截然不同的转录组变化，这也与在筛选中观察到的这些基因对于两种细胞存活的影响不同相吻合。比如基因MAT2A,它催化甲硫氨酸和ATP生成S-腺苷甲硫氨酸（S－adenosylmethionine，SAM），一种参与甲基转移反应的辅酶。在干细胞中敲低MAT2A,并不会引起很多基因表达的变化，同时也不会影响干细胞的存活。然而，在神经细胞中抑制MAT2A表达则会引起大量转录组的改变，包括许多参与到神经细胞特异性功能的基因，同时，敲低MAT2A会显著影响神经细胞的存活。在另外一些情况下，敲低同一个基因虽然会同时影响干细胞和神经细胞的存活，但在两种细胞中引发的转录组变化却不同，如基因UBA1。或者敲低同一个基因在两种细胞中对存活影响相同并且引起相同的转录组变化，如基因UQCRQ。另外，作者还观察到，在神经细胞中敲低MAP3K12，会引起抗凋亡基因Brn3a和促神经生长基因NRN1的表达上调以及促凋亡基因HRK、JUN和神经退行性疾病相关基因APP的下调，这可能解释了为什么在筛选中和其他报道中发现抑制MAP3K12有神经保护性的作用。
接下来，作者又研究了筛选出的影响细胞存活的基因是否会对神经元的细胞形态产生影响。作者开发了一套阵列式的长期成像（arrayedlongitudinalimaging）技术和自动化神经形态分析的图像处理方法。利用这些方法，作者可以对同一神经细胞进行长期跟踪成像以记录其形态的变化，包括神经突起（neurite）的长度，分支程度等。作者记录和分析了对照组和23个不同基因敲低组神经元在一段时间里的形态变化，发现虽然都会影响神经细胞存活，但是不同基因对神经元形态的影响不同。比如，敲低基因PPP2R1A会显著性的缩短神经突起的长度，并减少突起的分支数目，而敲低PGGT1B则会引起神经突起长度和分支数目的增加，后者的这一现象也被其他研究所报道。
综上，在这篇文章中，作者开发了一套在人类诱导多能干细胞分化的神经元中进行基于CRISPR干扰（CRISPRi）的高通量遗传筛选技术。利用这一技术，作者首先进行了大规模筛选，鉴定出了特异性影响神经细胞存活的基因。接着，为了探明机制，作者通过CROP-seq发现了敲低这些基因所引起的神经细胞特异性的基因表达变化，并通过阵列式的长期成像（arrayedlongitudinalimaging）手段观察到这些基因对于神经元形态的影响。这一技术可以被利用到筛选其他神经功能或神经疾病相关表型的基因，同时，由于这个平台是建立在干细胞中，所以其应用不只局限于神经细胞，而可以被应用到各种各样的不同细胞种类中。总之，这一技术为系统性阐述人类基因在不同细胞类型中的功能提供了有效的途径。
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