背景
尽管现代医学取得了巨大进步，但对老年痴呆症等与年龄相关的神经退行性疾病的有效预防或治疗策略仍然有限。目前，越来越多的证据表明，微小核糖核酸(miRNAs)越来越多地与年龄相关的疾病相关，并正在成为有希望的治疗靶点。尿石素A是由肠道细菌转化鞣花单宁产生的代谢化合物，据报道具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性。
结果
体外尿石素A处理对PC12细胞的影响
1.尿石素A保护PC12细胞免受H2O2诱导的细胞*性和保持生存力
为了评估尿石素A对PC12细胞的细胞*性和神经保护作用，进行了细胞活力和细胞*性试验。与对照组的生存力相比，暴露于H2O2的PC12细胞的生存力显著降低(P0.01)；然而，用尿石素A处理的细胞显著抑制了这种减少(均P0.01)，并具有显著的剂量-效应关系。此外，细胞*性试验的结果显示，与对照组相比，用H2O2处理导致LDH释放显著增加(P0.01)，并且尿石素A显著减弱了LDH活性的增加(均P0.01)。这些数据表明尿石素A对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤有保护作用。
2.尿石素A对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响
为了研究和证实尿石素A是否能抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，使用了膜联蛋白VFITC凋亡检测试剂盒。凋亡实验结果表明，暴露于H2O22h导致明显的凋亡，与对照组相比，凋亡率为73.45%(P0.01)。而尿石素A预处理显著降低细胞凋亡率(均P0.01)，浓度为50μg/mL的尿石素A组减轻H2O2诱导的细胞凋亡效果最好。结果表明，尿石症治疗有效地逆转了H2O2诱导的PC12细胞凋亡。此外，在H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤过程中，还观察了尿石素A对Bcl-2蛋白表达和裂解半胱氨酸蛋白酶-3的影响。与载体对照相比，用H2O2处理显著增加了Bcl-2的表达水平和胱天蛋白酶-3的活化(两者均0.01)).然而，尿石素A处理24h后，caspase-3和Bcl-2的蛋白表达明显受到调节(均P0.01)。
体内尿石素A治疗对D-半乳糖致衰老小鼠的影响
1.尿石素A对体重和脑指数的影响
衰老模型建立4周后，正常组小鼠活动活跃，对声、光敏感，毛发白而有光泽，粪便呈颗粒状，而模型组小鼠消瘦、无精打采、反应迟钝，毛发无光泽。然而，这些恶化的症状在尿石症组的小鼠中交替出现。实验结束时，与对照组相比，模型组大鼠的体重和脑指数均显著降低(P0.05)。尿石素治疗8周后，小鼠脑指数和体重均有明显改善(P0.05).
Fig1尿石素A对衰老小鼠体重和脑指数的影响。（A）尿石素对半乳糖致衰老小鼠体重的影响(B)尿石素A对D-gal致衰老小鼠脑指数的影响
2.尿石素A对小鼠行为学的影响
旷场实验
一个开放的空间被用来评估尿石素A对衰老小鼠自发运动的影响。
与对照动物相比，用D-半乳糖处理的小鼠穿过的方块数和在中央方块停留的时间都显著减少(P0.01)，这被认为是自发活动缺陷。然而，在我们的研究中，所有3个测试剂量的尿石素A都显著改善了这些自发活动缺陷(均P0.05)。
莫里斯水迷宫
为了评估尿石素A对衰老模型小鼠空间学习和记忆的影响，本研究采用莫里斯水迷宫。结果，长期服用D-半乳糖导致到达平台的潜伏期显著延长(P0.01)，并且在训练期间用尿石素A治疗显著降低了逃避潜伏期(P0.01)。在空间探索试验中，与对照组相比，D-gal处理的老龄小鼠进入平台的前一位置的次数更少(P0.01)，并且在目标区域花费的时间显著减少(P0.01)。有趣的是，尿石素A治疗组的小鼠在这些恶劣的条件下表现出显著的逆转。这些发现表明尿石素能恢复D-半乳糖诱导的记忆和学习能力的缺陷。
物体位置识别测试
与对照组相比，模型组在由D-gal引起的物体识别学习中表现出显著的缺陷，如测试试验中空间静止和空间移位的物体的物体探索时间减少(P0.01)。相比之下，给予尿石素A显著逆转了物体位置识别任务的这些变化(均P0.01)，表明尿石素A可以显著改善D-gal诱导的空间学习和记忆障碍。
3.尿石素A对小鼠生化指标的影响
尿石素A对全脑中乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶活性的影响
模型组乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶活性明显高于对照组(均P0.05)).与模型组全脑相比，D-半乳糖致衰老小鼠全脑乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶水平显著降低(均P0.05)。测试表明尿石素能改善认知障碍。
尿石素对脑超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性和丙二醛水平的影响
为探讨尿石素A对D-gal诱导的氧化应激的影响，测定了抗氧化酶活性和抗氧化剂含量。与对照动物相比，D-gal处理的小鼠的脑组织中的谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著降低，丙二醛水平显著增加(均P0.01)。然而，用尿石素A治疗衰老小鼠可以显著逆转脑组织中酶或非酶活性的降低。这些结果表明尿石素A可以减轻D-gal诱导的氧化应激，保护脑组织免受损伤。
肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6的测定
造模后脑组织中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-1β的炎症介质的表达显著增加，表明给予D-gal可导致衰老小鼠的慢性炎症状态。更重要的是，用不同浓度的尿石素A(50毫克/千克、毫克/千克或毫克/千克)治疗后，3种促炎细胞因子的水平明显低于用半乳糖激活的衰老组(P0.05)。
组织学发现
本研究采用HE和尼氏染色法分析小鼠脑组织的组织病理学特征。如苏木精-伊红染色所示，在D-gal诱导的衰老小鼠的CA3区观察到锥体细胞、核固缩、具有不规则神经元的无组织神经纤维和扩大的神经元间隙。而尿石素A治疗逆转了这些病理变化，高剂量尿石素A(mg/kg)治疗提供了最大的保护作用，在治疗组的形态结构上观察到微小的变化，与正常对照组几乎相同。在尼氏染色分析中，观察到海马组织的CA3区神经元明显受损或缺失。结果显示，模型组海马神经元数量明显减少；此外，衰老模型小鼠的尼氏体数量也明显减少。然而，经尿石素A处理的海马神经元数量明显恢复(P0.05)。这些结果表明，尿石素A治疗产生了显著的效果，改善D-半乳糖导致的海马损伤。
Fig2尿石素A治疗对脑组织病理学改变的影响，HE染色(A)和尼氏染色(B):(a)对照组；(b)模型组；H-UroA组；(d)MUroA组；(e)L-UroA组。(C)尼氏染色法检测海马组织中尼氏阳性细胞的数量。
4.尿石素A通过调节miR-34a介导的SIRT1/mTOR信号通路对D-Gal诱导的脑老化的保护作用
尿石素A下调D-Gal诱导的海马组织中的miR-34a
通过实时定量聚合酶链反应检测尿石素A干预前后海马组织中miR-34a的表达。目前的研究表明，各组小鼠海马组织中miR-34a的表达不同。与对照组相比，D-gal诱导的衰老小鼠miR-34a表达显著上调(P0.01)。相反，在服用尿石素A8周后，miR-34a的表达显著降低。这些发现表明miR-34a的上调与D-半乳糖诱导的小鼠脑老化呈正相关。
尿石素A通过上调SIRT1和下调p53/p21改善D-Gal诱导的海马神经元衰老
在这项研究中，研究了p53是否能诱导miR34a的表达，以及这种表达的增加是否受到尿石素A的调节，并用蛋白质印迹分析检测了p-p53、p53和p21的蛋白表达。在p53、p21和miR-34a之间观察到正相关；相比之下，尿石症治疗后这些变化明显减轻，且呈浓度依赖性(均P0.05).为了测试尿石素A对miR-34a的抑制是否受到SIRT1信号的特异性调节，我们还通过蛋白质印迹分析确定了尿石素A对SIRT1蛋白表达的影响。蛋白质印迹分析显示，在用D-gal慢性处理诱导衰老的小鼠中，SIRT1蛋白表达显著降低，而尿石素A显著逆转SIRT1蛋白表达的降低(均P0.01)。这些数据表明尿石素A与衰老小鼠的SIRT1和p53磷酸化的调节有关。
尿石素A抑制D-Gal诱导的细胞凋亡和挽救功能失调的自噬
与正常组相比，D-gal使D-gal给药小鼠的海马中裂解的半胱天冬酶-3明显增加，Bcl-2明显减少(P0.01)。相比之下，与模型组相比，治疗组尿石症患者裂解的caspase-3表达显著降低，Bcl-2表达显著上调(均P0.01)。这些数据表明尿石素A可以发挥抗凋亡功能，保护衰老小鼠免受D-gal诱导的细胞损伤。此外，还检测了与自噬功能状态相关的蛋白质的表达水平。与对照组相比，D-gal诱导的衰老模型组中Atg7蛋白的表达和LC3-II/LC3-I比值显著降低(P0.01)，表明D-gal给药明显诱导海马组织中功能失调的自噬。然而，自噬相关蛋白的下调被尿石素A预处理显著挽救(均P0.01)。此外，观察到D-gal诱导的衰老小鼠海马组织中p62水平显著升高，并且这些升高通过用尿石素A处理而减弱。
Fig3尿石素A对D-gal诱导衰老小鼠海马组织SIRT1/p53信号传导的影响(A)。尿石素A能减轻半乳糖致衰老小鼠海马组织过度凋亡(B)。
Fig4(A)尿石素A挽救了D-gal诱导的衰老小鼠海马组织中的自噬缺陷
尿石素A减弱D-Gal诱导的海马组织星形胶质细胞活化
与对照组相比，半乳糖诱导衰老模型组小鼠的GFAP表达显著增加(P0.01)。然而，用尿石素A治疗后，GFAP明显下调(均P0.01)。此外，免疫组织化学结果表明，在D-gal模型组中的GFAP水平明显高于对照组。有趣的是，与模型组相比，给予尿石素A导致GFAP免疫反应性星形胶质细胞的数量显著减少(P0.01)。这些发现增强了尿石素A对D-gal诱导的衰老小鼠的益处，进一步支持了尿石素A减轻了D-gal诱导的海马组织中星形胶质细胞的活化。
Fig4(B)尿石素A降低D-半乳糖致衰老小鼠海马组织中GFAP的过表达
尿石蛋白A抑制D-半乳糖致衰老小鼠海马组织中的mTOR信号通路
为了进一步评估mTOR的调节是否通过尿石素A介导的保护作用发生，我们通过蛋白质印迹分析评估了mTOR的表达。给予D-gal导致D-gal诱导的衰老小鼠海马组织中Ser(p-mTOR)mTOR磷酸化水平增加。此外，补充尿石素A显著逆转了mTOR表达水平的增加，表明自噬的激活是通过抑制尿石素A对mTOR信号的影响而发生的。
Fig4(C)尿石素A抑制半乳糖致衰老小鼠海马组织的线粒体受体激活
尿石素A对正常幼龄小鼠和自然衰老小鼠的影响
为了进一步研究尿石蛋白A对正常幼龄小鼠和自然衰老小鼠的影响，用尿石蛋白A治疗2个月龄和12个月龄小鼠，并测量这些小鼠海马组织中miR-34a的表达。尿石蛋白A显著降低了miR-34a在二月龄和十二月龄小鼠中的表达(P0.01和P0.01)。我们发现与2个月大的小鼠相比，12个月大的小鼠miR-34a表达显著增加(P0.01)。此外，我们还研究了尿石素A对正常年轻和自然衰老小鼠miR-34a介导的SIRT1/mTOR信号通路激活的影响。与Dgal诱导的衰老模型实验结果相似，尿石素A可以上调SIRT1和下调p53/p21，抑制凋亡和挽救功能失调的自噬，减弱星形胶质细胞活化，并抑制正常衰老小鼠海马组织中的mTOR信号通路。这些数据证实了这样的假设，即年轻啮齿动物中miR-34a的表达水平低于其伴侣，尿石素A通过激活miR-34a介导的SIRT1/mTOR信号通路对脑老化小鼠具有保护作用。图5尿石素A对正常幼鼠和自然衰老鼠海马组织SIRT1/p53信号的影响(A)。尿石素甲能减轻正常幼鼠和自然衰老鼠海马组织过度凋亡。
Fig5尿石素A对正常幼鼠和自然衰老鼠海马组织SIRT1/p53信号的影响(A)。尿石素甲能减轻正常幼鼠和自然衰老鼠海马组织过度凋亡(B)。
Fig6尿石素A挽救了正常幼鼠和自然衰老鼠海马组织的自噬缺陷(A)。尿石素A降低了GFAP在正常年轻小鼠和自然衰老小鼠海马组织中的过度表达(B)。尿石素A抑制正常年轻小鼠和自然衰老小鼠海马组织中mTOR的激活(C)。
总结
总之，尿石蛋白A激活的miR-34a介导的SIRT1/mTOR信号通路在D-gal诱导的衰老相关认知障碍中起着明显的保护作用。其潜在机制可能与尿石素A通过抑制胶质化星形胶质细胞的活化和抑制mTOR的活化以及下调miR-34a来诱导海马组织的自噬有关，这为尿石素A作为一种有前途的抗脑老化及其相关神经疾病的治疗药物的应用提供了理论基础和支持。
撰稿：周志豪
排版：刘珂安琪
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