撰文丨十一月
阿尔兹海默症,又称为老年痴呆症,病人体内神经元中自噬过程明显受损。自噬是溶酶体降解的主要途径,通过组成性地清除废弃蛋白和细胞器来维持细胞内稳态,是疾病和细胞应激进一步诱导消除异常蛋白质、聚集物和受损的细胞器。神经元中自噬溶酶体酸化过程与淀粉样蛋白的沉积,与最终导致神经元中斑块形成之间的因果关系还不甚清楚。为此,美国内森·克莱恩研究所RalphA.Nixon研究组与Ju-HyunLee(第一作者)合作在NatureNeuroscience发文题为FaultyautolysosomeacidificationinAlzheimer’sdiseasemousemodelsinducesautophagicbuild-upofAβinneurons,yieldingsenileplaques,通过在五种不同的阿尔兹海默症小鼠模型中检测神经元特异性溶酶体自噬探针变化,揭示出神经元中自噬溶酶体酸化发生早于淀粉样沉积过程。在更受损但仍然完整的神经元中,大量的Aβ阳性自噬液泡包裹成大的膜泡,形成花状核周莲座形状,作者们将这种模式成为神经元中的“毒之花”(PANTHOS),PANTHOS正是神经元异常斑块的主要来源。
为了检测体内溶酶体自噬功能障碍,作者们使用了可以在神经元中特异表达mRFP-eGFP-LC3转基因,该转基因的表达水平大约比内源性LC3水平高一倍,并且对自噬溶酶体信号通路的作用没有明显的影响。另外,该转基因中LC3与内源的LC3一样,会与自噬小体的结合,最后降解产生非荧光的溶酶体。自噬小体上的转基因LC3在自噬小体的中性pH下发出黄绿色的荧光(eGFP/mRFP),但是自噬溶酶体与溶酶体融合后逐渐成熟促使自噬溶酶体酸化,eGFP在pH6.0以下会淬灭,因此荧光会从黄色变为橙色最后变为红色(图1)。随后作者们在观测时候又引入了溶酶体的标记物比如CTSD、LAMP2等,用第三种荧光伪色比如蓝色进行可视化标记。因此,完全酸化的成熟溶酶体会表现出紫色(红色+蓝色),而非酸化的溶酶体(poorlyacidifiedAL,pa-AL)则会因为红色绿色与蓝色的同时存在而呈现白色(图1)。
图1神经元特异性溶酶体探针的工作基础
为了将利用该探针检测自噬溶酶体酸化与β-淀粉样蛋白沉积出现之间的因果关系,作者们使用了在10-12个月龄出现淀粉样斑块的小鼠模型。作者们发现在小鼠5月龄时,新皮质层中出现了酸化的荧光,且均不具有CTSD染色,说明这些都是非酸化的自噬溶酶体。到12月龄,神经元中溶酶体酸化的缺陷进一步增加,ATPase的活性也逐渐降低。通过时程追踪实验,作者们确认自噬溶酶体酸化缺陷的出现早于β-淀粉样蛋白的异常沉积。
进一步细化时程追踪实验,作者们发现10月龄的阿尔兹海默症小鼠模型中新皮层神经元中会逐渐累积扩大非酸化自噬溶酶体(图2),这些膨胀的溶酶体的酸化异常且自噬溶酶体成熟过程也存在缺陷。通过在五种不同的阿尔兹海默症小鼠模型中进行检测,作者们发现这种“毒之花”形态在不同小鼠模型中出现的时间虽然不同,但是自噬溶酶体产生缺陷的模式是可重复的(图2)。
图2阿尔兹海默症小鼠模型神经元中的“毒之花”
为了表征“毒之花”在神经元病变向成熟神经斑块的演变过程,作者们用Thio-S对其进行免疫标记,该标记可以用于检测致密核心老年斑。在2.2月龄的小鼠模型定量分析发现样本中有一半为Thio-S阳性,而在6月龄小鼠模型中,这一比例达到了95%以上。进一步地,为了描述具有“毒之花”神经元病变演变为成熟斑块的过程,作者们对反应性星形胶质细胞和小胶质细胞进行了免疫标记。当大量具有“毒之花”神经元表现出结构完整性的丧失时,相邻的具有“毒之花”的神经元合并为一个更大的结构,扩展为更大的老年神经斑块,逐渐形成了一个不断扩大的β-淀粉样蛋白中央核,导致细胞外致密核老年斑。
总的来说,作者们通过对五种不同的阿尔兹海默症小鼠模型内神经元自噬过程失调的研究的,揭示出神经元中自噬溶酶体酸化在细胞外淀粉样沉积之前就开始出现异常,大量含有Aβ淀粉样蛋白的自噬液泡累形成大的膜泡,形成莲花状结构,作者们将这种模式成为“毒之花”。具有“毒之花”的神经元正是阿尔兹海默症中老年神经斑块形成的主要来源。
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